细胞接收后的处理：

1）收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。

2）请在4或5X显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。

3）贴壁细胞：T25瓶置于37℃培养箱中约2-3h，显微镜下观察细胞的情况，若细胞密度在70%-80%左右，可进行传代，首次传代建议1:2(也可根据情况调整)，若细胞生长不足70%，建议消化处理后，转移到新的T25培养瓶（1：1）继续培养。

4）半贴细胞或贴壁不牢（悬浮）细胞：T25瓶置于37℃培养箱中约2-3h，显微镜下观察细胞的情况，若细胞密度在60%以下，客户需收集T25瓶中的悬浮细胞离心后用完全培养基重悬后打回到原培养瓶中继续培养，若细胞生长70%-90%对细胞进行传代，传代时需要收集培养基中悬浮的细胞离心后回收。

5）备注：运输用的培养基（灌注培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。  收到细胞后第一次传代建议T25培养瓶1：2传代 。

注意： 耐药细胞，需先无药培养稳定后保种再进行加药培养，按照3次梯度加药：最大剂量1/4，最大剂量1/2，最大剂量

细胞培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备培养基：F-12K基础培养基+10%FBS+1%P/S+0.5uM Oxaliplatin(用于维持抗药性)。

2）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5% 。 温度：37 摄氏度，培养箱 湿度为 70%-80%。

3）冻存液：FBS 90%+DMSO 10% ，现用现配

二．细胞处理：

1）冻存细胞的复苏：

将含有 1mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含 4-6mL 完全培养基的离心管中混合均匀。在 1000RPM 条件下离心 3-5min ，弃去上清液， 完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含 6-8ml 完全培养基的培养瓶（或皿） 中 37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2） 细胞传代：如果细胞密度达 80%-90% ，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

1.  弃去培养上清，用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次。

2.  加入 0.25％（w / v ）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA 于培养瓶中（T25 瓶 1-2mL ，T75 瓶 2-3mL） ，置于 37℃培养箱中消化 1-2 分钟（难消化的细胞可以适当延长消化 时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿 回操作台，轻敲几下培养瓶后加入 3-4ml 含 10%FBS 的培养基来终止消化。

3.  轻轻打匀后吸出，在 1000RPM 条件下离心 3-5min，弃去上清液，补加 1-2mL 培养液后吹匀。将细胞悬液按 1：2 的比例分到新 T25 瓶中，添加 6-8ml 按照说 明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况 按 1:2~1 :4 的比例进行。

3） 细胞冻存:  收到细胞后建议在培养前 3 代时冻存一批细胞种子以备后续实 验使用。下面 T25 瓶为例；

1.  细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血 球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为 1×106~1 ×107 个活细胞/ml.

2.  1000rpm 离心 3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞 ，按每 1ml 冻存液含 1×106~1×107 个活细胞/ml 分配到一个冻存管中将细胞分配到 冻存管中，标注好名称、代数、 日期等信息。

3.  将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80 度冰箱中过夜，之后转入液氮容器 中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

注意事项：

1.  所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作， 并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。

2.  建议在复苏冻存细胞时始终使用防护手套、衣服和戴上防护面罩。注意： 冻存管浸没在液氮中会泄漏，并会慢慢充满液氮。解冻时，液氮转化成气相可能 导致容器爆炸或用危险力吹掉其盖子，从而产生飞扬的碎屑造成人员伤害。